luciferase
雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒╨uciferase assay）是研究基因之間調(diào)控機制的方法之一，其闡述的是DNA-DNA,RNA-DNA的調(diào)控關(guān)系。常見的研究有轉(zhuǎn)錄因子TF與靶基因的調(diào)控、miRNA與靶基因的調(diào)控，miRNA與lncRNA/circRNA的調(diào)控。
這里以miRNA與靶基因的調(diào)控研究為例，描述luciferase的研究過程。
一、生物信息學(xué)分析
通過生物信息學(xué)分析預(yù)測miRNA與靶基因3'UTR區(qū)域的結(jié)合位點。根據(jù)結(jié)合位點序列設(shè)計突變位點序列。
二、載體構(gòu)建
分別構(gòu)建以下過表達質(zhì)粒：
1. miRNA過表達質(zhì)粒、miRNA-NC
2. 靶基因3'UTR野生型質(zhì)粒WT（LUC載體）
3. 靶基因3'UTR突變型質(zhì)粒MUT（LUC載體）
三、Luciferase檢測
1. 細胞培養(yǎng)：
以RPMI1640培養(yǎng)基擴增培養(yǎng)293T細胞，至指數(shù)生長期，1200rpm離心4min.
2. 細胞鋪板：
以血球計數(shù)板計數(shù)收集的293T細胞，調(diào)整細胞密度為105/ML,然后接種至24孔板，每孔的細胞數(shù)量4×104.
3. 細胞轉(zhuǎn)染：
根據(jù)lipo3000的操作說明進行共轉(zhuǎn)，共轉(zhuǎn)染分組如下：
A:miRNA + 靶基因3'UTR-WT
B:miRNA + 靶基因3'UTR-MUT
C:miRNA-NC + 靶基因3'UTR-WT
D:miRNA-NC + 靶基因3'UTR-MUT
每組同時轉(zhuǎn)染海腎熒光素酶質(zhì)粒pRL-TK作為內(nèi)參。
4. 雙熒光素酶活性檢測：
4.1 細胞裂解：
細胞轉(zhuǎn)染48h后，棄上清，并以PBS輕輕洗滌一次細胞，然后每孔加入200ul細胞裂解液，冰育5-10min,充分裂解細胞；
4.2 工作液配制：
按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書，分別以對應(yīng)的緩沖液稀釋螢火蟲熒光素酶底物、海腎熒光素酶底物至1×，冰上靜置；
4.3 熒光檢測：
取4.1中裂解液20ul,加入96孔酶標板中，加入100ul螢火蟲熒光素酶反應(yīng)液，放入酶標儀，設(shè)置震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶活性；
檢測完螢火蟲熒光素酶活性后，每孔加入100ul海腎熒光素酶反應(yīng)液，放入酶標儀，設(shè)置震板混勻，檢測海腎熒光素酶活性。
5. 數(shù)據(jù)分析、作圖。
